Övning: Förstå proteiner via dess struktur

I den här övningen ska du studera hur några proteiners funktion följer av deras tredimensionella form. Du ska då plocka fram strukturen via internet och analysera denna med olika verktyg via nätet. Innan du ger dig i kast med dessa uppgifter ska du dock bejkanta dig med den databas och det program du ska använda.

Bekanta dig med databaser och program

Vi börjar med att titta på ett enzym, som heter fosfofruktokinas. Detta tar en fosfatgrupp från ATP och sätter på sockermolekylen fruktos-6-fosfat.

(a) Gå till Protein database (PDBsum). Skriv namnet på proteinet (phosphofructokinase) i text-search rutan på sidans mitt.

(b) Nu får du en lista med länkar till olika strukturbestämningar av detta enzym. Vi väljer en struktur där du ser enzymet tillsammans med fruktos-6-fosfat och ADP, nämligen den med koden ”4pfk”. Klicka på denna kod. Du får nu upp en sida med uppgifter om proteinet och en bild av detta (se nedan).

(c) Klicka på ”Jmol” under bilden av proteinet (se pil 1). Ett fönster öppnas där det kommer en större bild på proteinet, ATP och fruktos-6-fosfat. Grip tag i proteinet med musen och dra i det. Prova dig fram tills du kan vrida proteinet i tre dimensioner.

(d) Den bild du nu fått upp kan inte bara vridas utan också manipuleras på en rad olika sätt med hjälp av en meny du får upp om du högerklickar i fönstret med den vridbara bilden (figur nedan). Med denna meny kan du välja hur såväl proteinet som de molekyler detta binder till ska återges:

Börja med att manipulera aminosyrekedjan på olika sätt. För musen över Select>Protein>All  och klicka där. Du har nu sett till att kommande manipulationer bara påverkar aminosyrekedjan, inte ATP och sockret. För sedan musen över Render>Scheme>CPK spacefill och klicka där. Proteinet återges nu som en rymduppfyllande modell. Prova sedan Render>Scheme>Sticks.och klicka. Du får nu proteinet representerat som nätverket av bindningar mellan dess atomer. Tyvärr behålls den schematiska ”pil och spiral”- bilden av proteinet samtidigt, men den blir du av med genom att föra musen över Render>Structures>Off och klicka.

(f) Du kan också manipulera färgerna vid återgivningen av aminosyrekedjan. Genom att föra musen över Color>Atoms>White eller kanske Color>Atoms> Blue>Azure får aminosyrekedjan en mindre intensiv färg, så att liganderna kontrasterar skarpare. Om du sålunda gett aminosyrekedjan en ljus färg och åter för musen över Render>Scheme>CPK spacefill och klickar där får du en god uppfattning om hur substratet och ADP är inbäddade i enzymet.

(g) Om du sedan för musen över Color>Atoms>By Scheme>Elements (CPK) och klickar där återges alla atomer i färger som anger atomslag (grått=kol, rött=syre, blått=kväve, gult=svavel; väte visas ej). Den stora mängden syre- och kväveatomer på ytan av proteinet övertygar om att detta protein är höggradigt hydrofilt (vattenälskande, vattenlösligt).

(h) Nu kan du emellertid inte urskilja ATP och sockret, men det är lätt åtgärdat om du för musen över Select>Hetero>Ligand och klickar varpå du ändrar ligandernas färg genom att föra musen över exempelvis Color>Atoms>Blue>Azure.

(i) Notera också att du från menyn kan zooma bilden in och ut, samt att du genom att föra musen över Spin kan få modellen att snurra i önskad hastighet och riktning.

(j) Om du manipulerat bilden så att du inte längre kan få den att se ut som du vill, stäng fönstret, klicka åter på Jmol och börja om

(k) Man kan också i detalj studera sockrets eller ATPs bindning till resten av proteinet: Stäng fönstret med den vridbara bilden så att du kommer tillbaka till sidan med olika uppgifter om proteinet. I vänstra marginalen finns en meny som kallas ”Content” med en underrubrik ”Ligands” (tidigare bild, pil 2). Klicka där på F6P ( vilket betyder fruktos-6-fosfat).

(l) Du får nu en bild som i ett plan skissar fruktos-6-fosfats bindningar till olika aminsosyror i proteinet. Invid bilden finns ikonen Jmol. Klicka på denna. Nu öppnas ett fönster med en tredimensionell projektion av liganden och de aminosyror den interagerar med, som på samma sätt som tidigare kan vridas, zoomas och fås att rotera. Notera hur sockret fixeras vid proteinet med hjälp av ett antal vätebindningar.

Uppgift 1: Bromsmediciner mot AIDS

Då HIV-viruset förökar sig tillverkas en lång aminosyrekedja, som måste klyvas i mindre bitar för att virusets olika proteiner ska bildas. Denna klyvning utförs av ett enzym som kallas HIV-proteas. Detta enzym har ingen motsvarighet bland människans egna proteiner, så ämnen som kan blockera HIV-proteas kan skydda mot AIDS utan att ge allvarliga biverkningar. I de kombinationsterapier som idag ges AIDS-sjuka är en inhibitor för HIV-proteas ett av de två verksamma medlen.

En inhibitor är oftast ett ämne som påminner mycket om enzymets naturliga substrat, och därför har lätt att binda till dess aktiva yta. Men som binder dit ännu starkare än substratet självt gör, utan att förändras av enzymet. Och som därför sitter kvar och hindrar det normala substratet från att komma till.

Ta fram strukturen för HIV-proteas bindande till någon inhibitor forskarna studerat. (Exempelvis strukturerna 1kzk eller 1npv). Använd de funktioner som beskrivits ovan till att besvara:

(a) Vilken form av sekundärstruktur finns i proteinet?
(b) När proteinet binder inhibitorn, är proteinet kompakt eller luftigt/spretigt?
(c) Är proteinets yta vattenhatande eller vattenälskande? Är det likadant över hela proteinets yta, eller finns ”undantag”?
(d) Hur stor andel av inhibitorns yta kommer i kontakt med omgivningen när den sitter bunden till proteinet, och hur mycket av den är ”gömd” inne i proteinet?
(e) Hur många vätebindningar finns mellan inhibitor och protein?

Uppgift 2: Transport av vitamin A i blodet

Retinol (ett förstadium till vitamin A) måste transporteras runt i kroppen, men ämnet är starkt hydrofobt (vattenhatande) och kan därför inte lösas i blodet. Studera strukturen för retinolbindande protein medan det binder retinol (1brp) och försök förklara hur proteinet gör det möjligt för retinol att transporteras i den vattenlösning, som blod utgör. Steg på vägen kan vara att betrakta

• proteinets form,
• var retinol befinner sig i förhållande till denna form,
• hur mycket av retinol som har kontakt med omgivningen utanför proteinet,
• vilka kemiska egenskaper den delen av retinolmolekylen har,
• vilka atomslag som finns på den yta av komplexet mellan protein och retinol, som kommer i direkt kontakt med blodet
• finns vätebindningar mellan retinolmolekylen och proteinet? Hur hålls retinolet på plats?

Titta sedan på proteinet utan retinol (1brq). Titta på proteinet återgivet med ”sticks”, dvs med bindningarna mellan proteinets atomer. Finns det utrymme ”kvar”, där retinol satt i den förra strukturen? Vad kan ha hänt? (Är retinols yta vattenälskande eller vattenhatande? Vad säger det om de ytor hos proteinet, som binder retinol. Vad kan hända med de ytorna, när retinol försvinner?)

Uppgift 3: Signaler om att kroppen ska växa

Tillväxthormon är ett litet protein som bildas i hypofysen och förs runt i kroppen, där det binder till receptorer på många celler, och säger till att kroppen måste växa.

Börja med att titta på hormonet (1hgu). Vilken typ av sekundärstruktur dominerar? Kan proteinet simma fritt i blodet (en vattenlösning). Dvs är hela hormonets yta hydrofil, eller finns där stora hydrofoba regioner?

Titta sedan på hormonet bindande till receptorn. Receptorn består av två identiska aminosyrekedjor, som bägge är förankrade i membranet. Av tekniska skäl är det dock mycket svårt att bestämma strukturen av de delar av ett protein, som befinner sig i ett membran. De delarna var därför bortklippta från det protein som strukturbestämdes och finns därför inte med på bilden. Fundera över var membranet borde befinna sig i denna modell och stäm av era funderingar med er lärare. Vilka sekundärstrukturelement dominerar den del av receptorn ni kan se? Hur stor del av hormonets respektive receptorns yta deltar i bindningen dem emellan? Tyvärr tycks man inte kunna få bindningar mellan de två proteinerna markerade, men utifrån er undersökning av hormonets yta, vilka slags bindningar borde det vara som får hormon och receptor att binda varandra?

Uppgift 4: Reglering av generna

Då våra celler ska styra hur mycket de ska tillverka av olika proteiner sker det genom att speciella styrproteiner (kallade transkriptionsfaktorer) binder DNA invid generna och därigenom underlättar eller försvårar avläsningen av genen. Dessa proteiner binder specifikt till DNA med en viss sekvens, och har alltså en form som passar som hand i handske med DNA-molekyler med en specifik sekvens. Några sådana proteiner spelar en viktig roll i den tidiga utvecklingen för att bestämma vilket organ eller kroppsdel en grupp av celler ska utvecklas till. Exempelvis kommer hos bananflugor ett ben att växa ut på den plats där det borde bilda en antenn, ifall genen är utslagen för proteinet antennapedia.

Börja nu med att titta på detta antennapedia-protein ensamt (1hom). Vilka sekundärstrukturer finns? Är proteinet vattenlösligt, eller finns där stora hydrofoba regioner?

Titta sedan på proteinet bundet till en bit DNA (1ahd). Proteinet känner igesin specifika DNA-sekvens genom att nå fram till kanten av basparen i klyftan mellan DNA-molekylens två socker-fosfatkedjor. Bara där sekvensen av baser är den rätta passar proteinet och kanten av basparen perfekt ihop. Vrid på bilden av proteinet och se efter om du tycker att detta påstående kan stämma. Gör så att atomerna i proteinet men inte DNA-molekylen representeras av rymduppfyllande bollar, och låt dessa färgsättas så man kan se av vilket grundämne atomerna är. Vrid sedan på bilden och se vad för atomer hos proteinet som sträcker sig in mot basparen. Betrakta samtidigt den kemiska uppbyggnaden av kvävebaser. Vilken slags bindningar är det rimligt att tro att formas mellan proteinet och kanten av basparen?

Till lärare

Syfte: Syftet är att fördjupa elevernas förståelse för proteiners byggnad och struktur och få dem att upptäcka det intima sambandet mellan proteinets struktur och dess funktion.

Förkunskaper: Eleverna måste kunna

• Begreppen hydrofil och hydrofob, det faktum att membranen har ett hydrofobt inre medan såväl cytoplasma som områden utanför celler är vattenlösningar där proteiner måste vara hydrofila för att trivas.
• Att proteiner är en ogrenad kedja av aminosyror, hur denna kan linda sig till alfahelixar och betasträngar, och hur dessa ofta illustreras som spiraler respektive pilar.

Kommentarer till några av uppgifterna:

Uppgift 2: Vad eleverna ska se är att proteinet när det binder retinol är som en tunna, i vilket hela den hydrofoba retinolmolekylen är gömd, och där den lilla del av retinolet som exponeras mot vattenlösningen i blodet just är den lilla hydrofila stump som finns i ämnets ena ände. Eftersom retinol är hydrofobt finns inga vätebindningar mellan retinol och protein, utan istället hydrofob interaktion. Därav följer att de ytor på proteinets insida som retinol binder måste vara hydrofoba. Då proteinet i sin icke-bindande form är ”hopsjunket” måste innerväggarna i den hopsjunkna proteintunnan ha bundit till varandra med hydrofob interaktion.

Uppgift 3: Om bilden är vriden så att signalämne binder i receptorns överdel skulle membranet ligga strax nedanför receptormolekylen. Eftersom både hormon och receptor har mängder av syren och kväven på de ytor som binder varandra hålls receptor och hormon uppenbarligen ihop av väte- och möjligen också jonbindningar.

Uppgift 4: Eftersom både proteinet och kanten av basparen har många kväve- och syreatomer måste denna interaktion ske med vätebindningar.